维生素D是在钙动态平衡的正调节中具有重要生理学作用的基本营养物。25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3（统称为总25-羟基维生素D）的血清水平是维生素D营养状况的指标，报道表明这两种形式的维生素D在生物活性和生物利用率上可能存在差异。研究显示25-羟基维生素D的低水平与各种疾病相关，诸如成人骨软化和儿童软骨病、肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、代谢综合症等。因此，维生素D的检测在临床上得到大量的应用。

   在样品制备过程中，加入稳定同位素标记的25-羟基维生素D2和稳定同位素标记的25-羟基维生素D3作为内标。待测物通过液液萃取的方法从血清中提取出来。

   样品提取后，经过液相色谱反相柱进行分离，然后将待测物离子化后进入质谱。质谱首先扫描母离子，并分离带有不同质荷比的母离子。母离子接下来在裂解池里被裂解成子离子。通过监测待测物的母离子和子离子对，质谱提供了一种具有高度特异性和灵敏度的检测手段。